锐谈 | Nat. Catal：利用电子通道的大肠杆菌代谢工程生产天然产物

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发布时间：2023-12-14 11:12
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在众多参与天然产物生物合成途径的酶中，真核细胞色素P450通常是决定生产效率的关键酶，可以催化脱氢、异构化、环氧化和羟基化等一系列反应。然而，真核生物P450s在细菌中的功能表达仍然普遍困难。除真核细胞色素P450的跨膜特性在细菌中并不常见之外，另一重要的问题是膜结合的P450s和P450s还原酶之间的物理距离会极大影响反应效率。因此，在涉及竞争反应或有毒中间体的多步生物合成途径中，通过使用支架蛋白将多种酶固定在邻近位置来引导底物的策略有助于提高整体反应速率并将代谢物快速转化为所需产物。

本文通过使用电子通道策略对E. coli进行代谢工程改造，并结合底物通道等其他代谢工程手段，实现了叶黄素、(+)-诺卡酮、芹菜素和左旋多巴的高效生产（图1）。

作者首先构建了生产叶黄素的E. coli菌株，在其基础上采用底物通道策略，利用Photorhabdus luminescens来源的支架蛋白CipA，使其通过形成具有酶活性的蛋白质结晶包涵体（PCI）将番茄红素ε环化酶（LUT2）和LCYBmut锚定在一起，从而提高叶黄素产量。

然而，大多数α-胡萝卜素没有转化为叶黄素，表明包含两个P450s的反应步骤是叶黄素生物合成途径的主要瓶颈。P450位于胞质，而其还原酶ATR2在细胞膜上，二者距离过大降低了电子传递效率。因此设计了一种电子通道策略，这次使用发光杆菌来源的支架蛋白CipB，将trLUT5、trLUT1和ATR2连接在一起，构建出LUT5M菌株，能产生5.8 mg/L叶黄素，是之前LUT4M菌株的3.41倍。

血红素是P450的辅酶，增加其产量可能提高电子传递效率。将与血红素合成有关的hemAfbr、hemL、hemB 和hemH四个基因以不同组合进行过表达，构建了LUT5MH1和LUT5MH2菌株，发现过表达hemAfbr和 hemL的LUT5MH1菌株能明显增加P450活性，叶黄素产量上升到10.34 mg/L。最终在优化的培养条件下通过补料分批发酵产生了218 mg/L叶黄素。

对于 (+)-诺卡酮、芹菜素和左旋多巴三种化合物，作者同样将电子通道策略运用到P450催化的生物合成步骤中，它们的产量均有不同程度的提高。但区别在于，在叶黄素的案例中融合CipB和酶（P450和P450还原酶）时不需要连接子，但这三种化合物的融合蛋白之间需要连接子。这种差异可能是由CipB和酶融合引起的几何变化以及CipB融合时表达水平的变化造成的。